Cell Counting Kit-8，簡稱
CCK-8試劑盒，是一種基于WST-8而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度、無放射性的比色檢測試劑盒。CCK-8溶液可以直接加入到細(xì)胞樣品中，不需要預(yù)配各種成分。WST-8在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺(生成的formazan量)和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系
CCK-8試劑盒操作說明
CCK-8試劑盒可以用于細(xì)胞因子等誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖檢測，也可以用于抗癌藥物等對細(xì)胞有毒試劑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性檢測，或一些藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制檢測。
1.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
a.先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞；
b.按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做5-7個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組4-6個(gè)復(fù)孔；
c.接種后培養(yǎng)2-4小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后每100霯培養(yǎng)基加10霯 CCK-8試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測定OD值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量。使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提條件是試驗(yàn)條件*一致。
2.細(xì)胞活性檢測
a.在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100霯/孔)，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)；
b.向每孔加入10霯的CCK-8溶液(注意不要產(chǎn)生氣泡)；
c.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)；
d.用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。
3.細(xì)胞增殖-毒性檢測
a.在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100霯/孔)，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)；
b.向培養(yǎng)板加入不同濃度的待測藥物；
c.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間；
d.向每孔加入10霯的CCK-8溶液(注意不要產(chǎn)生氣泡)；
e.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)；
f.用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。
CCK-8試劑盒注意事項(xiàng)
1.CCK-8的培養(yǎng)時(shí)間一般為1-4小時(shí)，但在培養(yǎng)30分鐘左右即可取出肉眼觀察顯色程度，根據(jù)細(xì)胞種類而定，需要摸索條件，CCK-8的*佳反應(yīng)時(shí)間以具體顯色的*佳時(shí)間為準(zhǔn)。
2.使用96孔板進(jìn)行檢測時(shí)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長，一定要注意蒸發(fā)問題。一方面，由于96孔板周圍一圈*容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加相同量的PBS、水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。
3.本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，所以還原劑(例如一些抗氧化劑)會(huì)干擾檢測，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設(shè)法去除。用酶標(biāo)儀檢測前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒有氣泡，否則會(huì)干擾測定。
4.加入藥物中如含有金屬，對CCK-8顯色有影響。終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì)抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降低。如果終濃度是10 mM的話，將會(huì)100%抑制。
5.培養(yǎng)基中的酚紅不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對檢測造成影響。
6.本產(chǎn)品可以檢測，但不能檢測酵母細(xì)胞。向100霯培養(yǎng)液中加入10霯 CCK-8溶液，并培養(yǎng)1-4小時(shí)或過夜。
7.CCK-8試劑盒對細(xì)胞的毒性非常低。它和活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶持續(xù)反應(yīng)使溶液顏色不斷加深，OD值不斷增加(注:活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶是持續(xù)產(chǎn)生的)。
8.要測定細(xì)胞的具體數(shù)量，建議同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
9.建議采用多通道移液器，以減小平行孔間的差異。
10.以下方法可以終止CCK-8反應(yīng)(96孔板)：
(a).在顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放置4°C冰箱內(nèi)
(b).每孔加10霯 0.1 M HCl溶液
(c).每孔加10霯 1%(w/v)的SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液
CCK-8試劑盒注意：反應(yīng)停止后，應(yīng)在24小時(shí)內(nèi)測定。
11.本產(chǎn)品于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。
12.為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
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