80年代后人們開始使用基因工程技術(shù)制備抗體，并進(jìn)而將抗體分子片斷與其它蛋白（或另一種抗體分子）融合得到多功能試劑，到目前為止，基因工程抗體在免疫測定上的應(yīng)用尚處于一個(gè)初級(jí)階段。且主要是將抗體與其它蛋白以融合蛋白形式表達(dá)而得到多功能試劑，如澳大利亞學(xué)者應(yīng)用基因工程技術(shù)制備了抗人紅細(xì)胞抗體與HIV-1gpN41的融合蛋白。這種重組蛋白，即基因工程雙功能試劑，在此基礎(chǔ)上，建立了快速，靈敏和特異的自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（AGEN）.
3.1 HIV-Elisa抗原/抗體試劑
1998年,美國首先研制第四代試劑,對檢測HIV的同時(shí)檢測P24（核心）抗原,故稱HIV抗原/抗體試劑,國內(nèi)已有引進(jìn).
抗原組成:gp160gp36gp170和單克隆抗p24抗體包被.
3.1.2 P24抗原測定
采用夾心法Elisa,即將將純化的已知抗體包被，當(dāng)加入帶測血清后，若血清中含有P24與包被抗體形成抗原抗體復(fù)合物，再加入酶（HRP）標(biāo)記HIV抗體。在抗原上又結(jié)合了酶標(biāo)記的抗體，加底物 顯色后在酶標(biāo)儀上讀結(jié)果。
近來為提高檢測血清中P24抗原的敏感性，將血清中免疫復(fù)合物（ICD）解離后再進(jìn)行測定。發(fā)展了（ICD） P24抗原測定技術(shù)。
3.1.3抗HIV-Elisa試劑
目前對HIV的檢測原料有了較大改進(jìn)，主要如下：
（1）可用于檢測血清或血漿中HIV IgM亞特異性抗體和檢測HIV-1、2和多種亞型。
（2）標(biāo)記的抗原：
a.含HIV-1B亞型gp41和P24的HIV-1重組融合蛋白。
b.可特異性檢測血清或血漿中HIV M群的抗體，絕大多數(shù)HIV-1.0群和HIV-2群的抗體。
c.gp36免疫調(diào)控區(qū)的HIV-2多肽可測定特異性的HIV-2抗體。
d.gp41的倆段HIV 1.0群多肽，可測特異性HIV 1.0 群的抗體 和HIV 1M群的抗體。
從以上抗原設(shè)計(jì)保證HIV的來自不同亞型/或區(qū)域的抗原亞型抗體的檢測。減少了變異株的漏檢。
HIV-1.0.2對759份各類臨床樣品包括401份HIV-1感染不同階段病人樣品，204分HIV-2感染不同階段病人樣品，和154份與HIV無關(guān)的其他疾病患者的樣品的檢測結(jié)果。
特異性：99.93% 靈敏度：100%
對歐洲血液中心的8842份常規(guī)鮮血者樣品用HIV-1.0.2進(jìn)行評價(jià)篩選，并經(jīng)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果。
3.1.4 HIV 確認(rèn)試劑—免疫印記（WB或RIBA）試劑
判斷標(biāo)準(zhǔn)
我國 HIV 抗體陽性：至少二條膜帶（即gp160/gp120）或至少一條膜帶和p24（核心）帶同時(shí)出現(xiàn)
美國 HIV-1陽性（任何兩個(gè)中有二條帶（P24 gp41 gp120/gp160）, HIV-2無陽性
WHO : HIV -1 陽性（不管有無核心帶或酶帶， 但有兩條膜帶）
HIV-2陽性（不管有無核心帶或酶帶，單有兩條膜帶即為陽性）
基因工程酶及其融合蛋白
除了基因工程抗原、抗體外，與標(biāo)記免疫測定有關(guān)的另一中重要的基因工程試劑就是酶及其融合蛋白，以重組酶建立免疫測定方法較為成功的是CEDIATM均相酶免疫試驗(yàn)。
使用基因工程酶技術(shù)生產(chǎn)免疫測定標(biāo)記酶，是得到符合標(biāo)記要求的高純度酶的一條新途徑，但如以其他蛋白（抗原或抗體）融合的方法，不但避免了繁瑣且低效率的酶與蛋白的化學(xué)交聯(lián)，而且無需得到純化的酶和抗原或抗體。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將有越來越多的酶免疫測定方法建立在基因工程酶或其融合蛋白的基礎(chǔ)之上。
發(fā)展趨勢如下：
1）、由單一病原蛋白向多決定簇融合蛋白轉(zhuǎn)變，并盡可能包括病原體基因組功能區(qū)的所有的能引起肌體免疫應(yīng)答的決定簇。
2）、表達(dá)的抗原將盡可能少含有非特異性抗原 或共同抗原。
3）、為某一目的如病原體基因型確定而設(shè)計(jì)表達(dá)特定的多肽抗原片斷。
總之，將圍繞改善免疫測定的特異性和敏感性來制備基因工程片斷。 |
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